Skip to content

przychodnia mokotów warszawa nfz

4 miesiące ago

298 words

Najpierw przygotowaliśmy wektory ekspresyjne zawierające wszystkie możliwe kombinacje FZD8 i LRP6, które transfekowano do komórek HEK293. Następnie wprowadziliśmy wektor ekspresyjny ACLP, wektor ekspresyjny WNT3A lub wektor kontrolny, a następnie test TOPflash / FOPflash. Gdy FZD8 lub LRP6 były poddawane wyłącznie nadmiernej ekspresji, aktywność reportera TOPflash była bardzo niska, nawet wtedy, gdy wyrażono ACLP (Figura 5A). Przeciwnie, gdy ekspresjonowano zarówno FZD8, jak i LRP6, następna ekspresja ACLP powodowała wysoką aktywność reportera (Figura 5A). Analiza metodą Western blot wykazała, że ekspresja ACLP znacząco indukowała akumulację k-keniny tylko wtedy, gdy zarówno FZD8, jak i LRP6 były eksprymowane wcześniej, co było zgodne z wynikami testu TOPflash / FOPflash (Figura 5A). Konsekwentnie, ekspresja ACLP znacząco indukowała ekspresję mRNA Axin2 tylko przy równoczesnej ekspresji FZD8 i LRP6 (Figura 5A). Ekspresja WNT3A, stosowanego jako ligand aktywujący dodatnią kontrolę WNT, dała wyniki identyczne z obserwowanymi dla ekspresji ACLP Tg (Figura 5A). Figura 5 ACLP aktywuje kanoniczną sygnalizację WNT / y-kateninę przez FZD8 i LRP6. (A) Kombinacje wektorów reporterowych luflferfliny FLflflash i FOPflash, wektorów ekspresyjnych ACLP, WNT3A, LRP6 i FZD8 oraz wektor kontrolny transfekowano do komórek HEK293, a następnie hodowano przez 36 godzin (n = 5 / grupę). (Lewy panel) Kwantyfikacja wewnątrzkomórkowej ekspresji lucyferazy. (Środkowy panel) Western blot dla (3-kateniny. (Prawy panel) Kwantyfikacja mRNA AXIN2. (B) Oprócz wektorów ekspresyjnych LRP6 i FZD8, wektor reporterowy luflferazy TOPflash lub FOPflash transfekowano do komórek HEK293. Po 24-godzinnej hodowli, rACLP podawano we wskazanych stężeniach razem z DKK-1 (20 ng / ml), FZD8CRD (20 .g / ml) i przeciwciałem anty-ACLP (10 .g / ml) (n = 5). /Grupa). Po 12 godzinach hodowli komórki analizowano. (Lewy panel) Ilościowe określenie wewnątrzkomórkowej ekspresji lucyferazy. (Środkowy panel) Western blot dla (3-kateniny. (Prawy panel) Kwantyfikacja mRNA AXIN2. * P <0,05; ** P <0,01 względem grupy kontrolnej (bez rACLP). Wartości P otrzymane za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z testem post hoc Tukeya. Dane są wyświetlane jako SEM. W komórkach HEK293 z nadekspresją zarówno FZD8, jak i LRP6, zastosowaliśmy test TOPflash / FOPflash po dodaniu rACLP. Aktywność reportera TOPflash wzrosła w sposób zależny od stężenia rACLP, który został zrównoważony przez dodanie DKK-1, rozpuszczalnego inhibitora WNT FZD8CRD lub przeciwciała przeciw ACLP (Figura 5B). Podobnie wewnątrzkomórkowa akumulacja .-kateniny i ekspresja mRNA Axin2 znacznie wzrastały w sposób zależny od stężenia rACLP, który został zniesiony po dodaniu DKK-1, FZD8CRD lub przeciwciała przeciw ACLP (Figura 5B). Aby zbadać formę wiązania ACLP z FZD8 i LRP6, badaliśmy, czy ACLP wiąże się z domenami zewnątrzkomórkowymi FZD8 i LRP6. Wektory ekspresyjne kodujące ludzką IgG sprzężone z zewnątrzkomórkową domeną ludzkiego LRP6 (LRP6N-IgG), ludzką IgG połączoną z domeną bogatą w cysteinę (CRD) mysiego FZD8 (FZD8CRD-IgG) i myszy znakowanej DDK ACLP (ACLP-DDK ) kotransfekowano do komórek HEK293. Po immunoprecypitacji lizatów komórkowych analiza Western blot wykazała istnienie kompleksów immunologicznych LRP6N-IgG / ACLP-DDK i FZD8CRD-IgG / ACLP-DDK (Figura 6A). Następnie, w celu potwierdzenia wiązania w warunkach pozbawionych komórek, eksprymowaliśmy mysie konstrukty LRP6N-IgG i FZD8CRD-IgG w komórkach HEK293 w celu przygotowania oczyszczonych białek (22). Mieszaniny LRP6N-IgG i FZD8CRD-IgG z ACLP-DDK analizowano metodą immunoprecypitacji i Western blotting, które ujawniły istnienie kompleksów immunologicznych LRP6N-IgG / ACLP-DDK i FZD8CRD-IgG / ACLP-DDK (Figura 6B). Podobnie, przygotowaliśmy mysie białko FZD8CRD-His, które zostało zmieszane z LRP6N-IgG, ACLP-DDK lub obydwoma LRP6N-IgG i ACLP-DDK [więcej w: guzowatość piszczeli, wbc podwyższone, lodowaty kwas octowy ]

0 thoughts on “przychodnia mokotów warszawa nfz”