Skip to content

chirurg plastyczny kraków nfz

4 miesiące ago

62 words

Znakowane GFP cDNA DNA-PKC-DNA (GFP FL-PK) lub pusty wektor GFP (GFP) transfekowano do kontroli 1BR3, pacjenta, zespołu 180BR LIGIV i komórek macierzystych hTERT. 24 godziny po transfekcji komórki napromieniano 3-y-rami, a ogniska 53BP1 w komórkach GFP + wyliczono po 8 i 16 godzinach. Identyfikacja komórek GFP + była krytyczna, ponieważ częstotliwość transfekcji z użyciem dużego cDNA DNA-PKcs i ludzkich fibroblastów była niska (<1%). Istotną korektę defektu naprawczego DSB komórek pacjenta zaobserwowano po ekspresji cDNA DNA-PKcs o pełnej długości. Nie zaobserwowano żadnej korekty po transfekcji cDNA DNA-PKcs o pełnej długości do komórek z zespołem LIGIV. p.A3574V lub utrata egzonu 16 dramatycznie upośledza funkcję i aktywność DNA-PK. A3574, który znajduje się poza domeną kinazy w dużej domenie FAT, jest wysoce konserwatywną resztą w DNA-PKcs (Figura 4E). Niemniej jednak zamiana alaniny na walinę nie stanowi dramatycznej zmiany. Aby uzyskać dokładniejszy wgląd w to, czy p.A3574V wpływa na funkcję DNA-PKcs, to podstawienie wprowadzono do cDNA DNA-PKcs przez ukierunkowaną mutagenezę i klonowanie. WT i zmutowane konstrukty PRKDC wprowadzono do V3, linii komórkowej CHO, która nie ma funkcjonalnego DNA-PKcs (37). Wyizolowano stabilne klony i do dalszych badań wybrano te, które wyrażały równoważne poziomy DNA-PKcs (określone przez immunoblotting). W celu sprawdzenia, czy podstawienie p.A3574V wpływa na funkcję DNA-PKcs w odpowiedzi na wywołane uszkodzeniem DSB, testy klonogennego przeżycia przeprowadzono po ekspozycji na zeocynę wywołującą DSB (Figura 6A). Podczas gdy ludzki DNA-PKcs WT zasadniczo odwracał wrażliwość zeocyny komórek V3, komórki wyrażające mutanta p.A3574V były tak samo wrażliwe na zeocynę jak te transfekowane pustym wektorem. Wnioskujemy, że DNA-PKcs A3574V zasadniczo zakłóca funkcję DNA-PKcs w odpowiedzi na wywołane uszkodzeniem DSB. Figura 6A3574V i eksonu 16a z delecją DNA-PKcs upośledzają aktywność kinazy DNA-PKcs i funkcję DNA-PKcs w odpowiedzi na uszkodzenie DNA i podczas rekombinacji V (D) J. (A) pełnej długości, A3574V lub usunięty DNA ekson 16y-PKcs lub pusty wektor przejściowo transfekowano do komórek V3 z uszkodzonym chomika DNA-PKcsa. 48 godzin po transfekcji komórki eksponowano na zeocynę, jak wskazano, a przeżycie oszacowano 7 dni później. Pokazano również ekspresję DNA-PKc po analizie Western blotting. Należy zwrócić uwagę, że cDNA DNA eksonów 16k usunięto klonowano do odrębnego wektora (RMCE) w porównaniu z cDNA DNA A3574V (pCMV); ten pierwszy jest ulepszonym wektorem dużych insertów i został użyty w późniejszych badaniach. Analizy przeżycia przy użyciu tych 2 wektorów przedstawiono oddzielnie. (B) Szacowana procentowa rekombinacja połączeń kodujących w komórkach V3 po ekspresji pełnej długości, A3574V lub ekson16f usuniętego DNA-PKcs lub pustego wektora razem z plazmidami kodującymi rekombinazę RAG i substrat rekombinacyjny, który ocenia kodowanie końcowego łączenia. (C i D) Oszacowanie aktywności DNA-PK w ekstraktach z całych komórek z komórek V3 eksprymujących pełnej długości, A3574V lub ekson 16a z usuniętym DNA-PKcs lub pustym wektorem. DNA-PK ekstrahowano przy użyciu kulek DNA. Celulozy, a aktywność oceniano stosując biotynylowany peptyd p53 jako substrat (C) lub przez badanie autofosforylacji po analizie metodą Western blotting i analizę z użyciem DNA-PKcs lub przeciwciał fosfo-2056. DNA-PKcs (D ). Następnie zbadaliśmy, czy A3574V DNA-PKcs może działać w celu naprawy DSB indukowanych przez RAG podczas rekombinacji V (D) J. Rekombinację V (D) J można oceniać w komórkach somatycznych przy użyciu substratów plazmidowych wprowadzonych do hodowanych komórek razem z genami rekombinacji RAG (38). Komórki V3 transfekowano wektorami ekspresyjnymi RAG, substratem rekombinacji, który ocenia kodowanie łączące koniec, jak również WT, mutantem lub brakiem cDNA DNA-PKC
[hasła pokrewne: kaszak na plecach, neosine syrop opinie, pękające pięty przyczyny ]

0 thoughts on “chirurg plastyczny kraków nfz”