Skip to content

przepisy na niskokaloryczne jedzenie

4 miesiące ago

587 words

Aby to udowodnić, startery zaprojektowano w egzonach 15 i 17. RT-PCR wykorzystujący cDNA otrzymany z komórek kontrolnych ujawnił pojedynczy produkt, podczas gdy 2 oddzielne prążki zaobserwowano przy użyciu komórek pacjenta (Figura 4C). Produkty amplifikacji RT-PCR sklonowano i zsekwencjonowano poszczególne klony. Podczas gdy wszystkie klony z kontrolnej linii komórkowej wykazały przewidywaną sekwencję obejmującą ekson 16, około 50% (10 z 20) klonów pochodzących od pacjenta nie miało eksonu 16 (pozostałe 50% zawierało ekson 16). Co ważne, to usunięcie nie miało wpływu na ramkę odczytu. Jest to zgodne ze stwierdzeniem, że 50% produktów amplifikacji RT-PCR pochodzi z cDNA z usuniętym eksonem 16, co pokazuje, że nie było znaczącego rozpadu z udziałem nonsensu (NMD). Aby potwierdzić normalną ekspresję usuniętego allelu egzon 16a, przeprowadziliśmy ilościowe analizy RT-PCR w celu określenia poziomów transkryptu pełnej długości WT, eksonu 16a usuniętego i zmutowanych alleli PRKDC u pacjenta, matki i normalnej kontrola (fig. 4D). Zmutowany allel c.10721C> T był eksprymowany w podobnym zakresie u pacjenta i matki, natomiast nie wykryto zmutowanego cDNA w normalnej kontroli. Co ważne, allel WT c.10721C był prawie 2-krotnie wyższy w normalnej kontroli względem pacjenta lub matki. To silnie wskazuje, że usunięty ekson 16a, c.10721C i c.10721C> allele T są wyrażane na podobnych poziomach, a zatem są równie stabilne. Na koniec zbadaliśmy cDNA DNA-PKcs od 15 zdrowych osób i nie zaobserwowaliśmy żadnego nieprawidłowego splicingu z udziałem eksonu 16, co sugeruje, że nie jest to powszechny wariant splicingowy. Sekwencjonowanie eksonu 16 z genomowego DNA pacjenta ujawniło prawidłową sekwencję. Dodatkowo, intron 16 został zsekwencjonowany od pacjenta i zidentyfikowano mutację IVS16 + 1510insA 700 bp powyżej miejsca splicingu. Ta zmiana nie była obecna w genomowym DNA matki (Supplemental Figure 1, dostępna online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI67349DS1). Jednakże, biorąc pod uwagę znaczną odległość tej zmiany od miejsca składania eksonów 15/16, nie jest jasne, czy jest to przyczynowo-skutkowa zmiana mutacji powodująca pominięcie eksonu. Zmiana ta nie była jednak zgłoszonym polimorfizmem ani SNP (Suplementowa Figura 1). Podsumowując, komórki pacjenta zawierały zmiany mutacyjne w PRKDC. Allel pozyskany z matki generował zmutowane białko p.A3574A. Dodatkowo zidentyfikowaliśmy anomalię splicingu generującą cDNA bez egzonu 16. Lokalizację tych mutacyjnych zmian i krytycznych domen w PRKDC pokazano na rysunku 4E. PRKDC uzupełnia defekt naprawy DSB obserwowany w komórkach pacjenta. Do testowania komplementacji użyto poprzednio skonstruowanego cDNA DNA-PKcs znakowanego GFP (36). Kontrolne 1BR3 i fibroblasty hTERT pacjenta transfekowano cDNA DNA-PKC i eksponowano na 3 Gy IR 48 godzin później, a ogniska. H2AX wyliczono na 0,25, 8 i 16 godzin po IR w komórkach barwiących dodatnio na GFP. Barwienie GFP stosowano do identyfikacji i analizy jedynie transfekowanych komórek, które stanowiły mniej niż 10% populacji komórek (oczekiwano, biorąc pod uwagę rozmiar cDNA DNA-PKcs i zastosowanie fibroblastów pacjenta). Uderzające, zaobserwowaliśmy prawie całkowitą korektę defektu naprawy DSB w komórkach hTERT pacjenta wyrażających DNA-PKcs (Figura 5). Jako kontrolę, cDNA DNA-PKcs również transfekowano do komórek TERT z zespołem LBRIV 180BR; zgodnie z oczekiwaniami nie obserwowano żadnego uzupełnienia ubytku naprawy DNA. Podobnie, transfekcja komórek hTERT z kontrolą 1BR3 lub komórkami hTERT matki pacjenta z cDNA DNA-PKC nie wpłynęła na komórki. stawka naprawy DSB. Łącznie, dane te dostarczają przekonujących dowodów, że defekt naprawy DSB obserwowany w komórkach pacjentów jest konsekwencją upośledzonej funkcji DNA-PKcs. Figura 5 cDNA DNA-PKC łączy się z defektem naprawy DSB obserwowanym w komórkach pacjenta
[patrz też: krosta na wardze sromowej, ganglion na nadgarstku, ślepota zmierzchowa ]

0 thoughts on “przepisy na niskokaloryczne jedzenie”