Skip to content

stomatolog grunwaldzka

4 miesiące ago

23 words

Supernatanty traktowano DNAzą I (Roche Diagnostic) przed ich ultrawirowaniem, a powstałe peletki ponownie zawieszano w PBS, porcjowano, a następnie zamrażano w <80 ° C aż do użycia. Ilość białka kapsydu p24 oznaczono ilościowo za pomocą testu ELISA antygen p24 HIV-1 (Beckman Coulter). Wszystkie transdukty znormalizowano względem ilościowego oznaczenia białka kapsydowego p24. Ludzkie tkanki. Ludzkie trzustki płodowe ekstrahowano z fragmentów tkanek, które otrzymano natychmiast po planowym zakończeniu ciąży w 7 do 11 tygodnia ciąży. Wiek ciążowy określono na podstawie ostatniej miesiączki, długości korony i zadu mierzonej ultrasonograficznie oraz morfologii dłoni i stóp. Ludzkie wysepki przygotowano jak opisano wcześniej (10). Pochodzenie człowieka. linia komórkowa EndoC-P H2. EndoC-P H2 otrzymano tak jak opisano wcześniej z niewielkimi modyfikacjami. Pokrótce, ludzkie płodowe eksplantaty trzustkowe uległy kotransdukcji z wektorami lentiwirusowymi loxP.RIP405-SV40 LT pTRIPP3 i loxP.RIP405-SV40 LT i pTRIPPU3 loxP.RIP405-hTERT. Następnie zostały przeszczepione pod osłoną nerkową myszy SCID, jak opisano wcześniej (10). Po 6 6 miesiącach w tkance przeszczepionej powstał insulinoma. Trzy kolejne rundy przeszczepu u myszy SCID zastosowano do amplifikacji komórek insulinoma przed ustanowieniem linii komórkowej. Sub-przeszczepianie i warunki hodowli opisano gdzie indziej (10) Immunobarwienie trzustkowych eksplantatów i linii komórkowych. Tkanki utrwalano w 3,7% formaldehydzie przed ich osadzeniem w parafinie. Dla immunohistochemii, przygotowano i poddano obróbce sekcje (o grubości 4 urn), jak opisano wcześniej (10). W celu immunocytochemii, komórki EndoC-aH2 hodowano na szklanych szkiełkach 12 mm, które powleczono Matrigelem i fibronektyną. Po 5 dniach komórki utrwalono przez godzinę w 4% paraformaldehydzie. Do immunobarwienia zastosowano następujące przeciwciała: przeciwciało przeciw insulinie świnki morskiej (1/500; A0564, DakoCytomation); szczurzy anty-ludzki peptyd C (1/3000, AB1921, Beta Cell Biology Consortium); mysiego anty-glukagon (1/2000; G2654, Sigma-Aldrich) lub króliczego anty-glukagonu (1/1000; 20076-Immuno, Euromedex); królicze przeciwciało przeciw somatostatynie (1/500; A0566, DakoCytomation); mysia anty-chromogranina A (1/50; M0869, DakoCytomation); królicze przeciwciało przeciw ludzkiemu PDX1 (1/2000) (39) królicze przeciwciało anty-NKX6-1 (1/500; AB1069, Beta Cell Biology Consortium); królicze przeciwciało anty-SOX9 (1/500; AB5535, Millipore); królicze przeciwciało anty-amylazowe (1/300, A8273, Sigma-Aldrich); mysz anty-SV40 LT (1/50; DP-02, Calbiochem Merck Biosciences); mysi anty-ludzki antygen Ki67 (1/50, M7240, DakoCytomation); królicze przeciwciało anty-karboksypeptydazy A (1/500; 1810-0006); szczurzą przeciwciało anty-BrdU (1/500; OBT0030, AbD Serotec); i mysie przeciwciało rekombinazy przeciw Cre (1/500, CRE-2D8-AS, Euromedex). Wtórnymi przeciwciałami były przeciwciało przeciw-królicze fluoresceiny (1/200; 711-096-152, Jackson Immunoresearch Laboratories, Beckman Coulter); fluoresceinowe przeciwciało przeciw mysiem (1/200, IM0819, Immunotech); Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-szczurze (1/500; A11006, Invitrogen); i Texas czerwone przeciwciało przeciw śwince morskiej (1/200; 706-076-148, Jackson Immunoresearch Laboratories). Cyfrowe obrazy trzustkowych eksplantatów i linii komórkowych zostały wychwycone przy użyciu chłodzonej, 3-chipowej kamery z aparatem ze sprzężeniem ładunkowym (Hamamatsu C5810, Hamamatsu), która została przymocowana do mikroskopu fluorescencyjnego (Leica, Leitz) lub z mikroskopem konfokalnym Olympus Fluoview FV1000. Analiza Western blot. Lizaty białkowe poddano immunoblottingowi, jak opisano wcześniej (40). Zastosowano następujące przeciwciała: CDK1 (1 / 1,000, ab18, Abcam), CDK4 (1 / 1,000, ab6315, Abcam), CCND1 (1/1000, RM-9104-S1, NeoMarkers), CCND3 (1/1000; 2936, sygnalizacja komórkowa), CCNE2 (1/1000, ab40890, Abcam), CCNB2 (1 / 1,000, ab18250, Abcam) i P-aktyna (1/2000, A5441, Sigma-Aldrich)
[podobne: podgłośniowe zapalenie krtani, abrazja ginekologia, ślepota zmierzchowa ]

0 thoughts on “stomatolog grunwaldzka”