Skip to content

kraków ul białoruska 15

2 miesiące ago

616 words

Kontrolne komórki 1BR3 i połączone z pacjentem komórki fazy G0 eksponowano na promienie 3 Gy w obecności lub nieobecności 5. M DNA-PKi, a liczbę ognisk. H2AX wyliczano we wskazanych czasach. Znacznie zmniejszona ekspresja DNA-PKcs i aktywność w komórkach pacjenta. Następnie przeprowadziliśmy immunoblotting 7 rdzeniowych białek NHEJ, a także LIS1, białka często niedostatecznego u pacjentów wykazujących lissencephaly, co również oceniono jako przyczynę (rysunek 3A). Co uderzające, chociaż większość białek NHEJ ulegała ekspresji na normalnych poziomach, ekspresja DNA PKcs była dramatycznie zmniejszona w komórkach pacjenta. Jednak resztkowe białko DNA-PKcs było wykrywalne i zweryfikowane przez porównanie z M059J, ludzką linią komórek nowotworowych, która nie ma ekspresji DNA-PKcs (34). Co więcej, komórki macierzyste pacjenta wykazały około 50% poziomu DNA-PKc obserwowanego w komórkach kontrolnych (Figura 3B). Figura 3. Zredukowana ekspresja DNA-PKcs i aktywność w komórkach pacjenta. (A) Analiza Western blotting pokazuje zredukowane białko PKC-DNA w komórkach pacjenta. Wyciągi z całych komórek (50 .g) z kontroli 1BR3 lub komórek pacjenta poddano obróbce w kierunku Western blotting przy użyciu wskazanych przeciwciał. (B) Analiza Western blotting potwierdziła, że resztkowe białko DNA-PKcs zostało zwalidowane wobec ludzkich komórek nowotworowych, M059K i M059J. Komórki M059J mają wartość zerową dla DNA-PKcs (53). (C) Aktywność kinazy zależnej od DNA-PKa3 badano stosując lizaty całych komórek od kontroli kontrolnej 1BR3, matki i unieśmiertelnionych pierwotnych fibroblastów hTERT u pacjenta. Dodatkowo, analiza ilościowa aktywności DNA-PKcs obecnych w fibroblastach hTERT pochodzących z komórek kontrolnych (1BR3), pacjenta i komórek macierzystych nie wykazała wykrywalnej aktywności DNA-PK w komórkach pacjenta hTERT i około 50% poziomu aktywności WT u matki. s komórki hTERT (Figura 3C). Test ten jest bardzo czuły i szacujemy, że 1% poziomu kontroli byłby wykrywalny. Wyniki te potwierdziły głęboką wadę aktywności DNA-PK w komórkach pacjenta. Mutacyjne zmiany w PRKDC. DNA-PKcs jest jednym z największych znanych cDNA (35). Aby wyszukać mutacyjne zmiany, 9 zachodzących na siebie fragmentów PCR z cDNA DNA-PKcs amplifikowano i zsekwencjonowano z kontroli i pacjenta, ujawniając mutację c.10721C> T w allelu pacjenta, tworząc substytucję aminokwasową alaniny na walinę w wysoce konserwatywna pozostałość 3574 (p.A3574V) (Figura 4, A i E). Matka również nosiła tę mutacyjną zmianę. Figura 4Identyfikacja mutacyjnych zmian w cDNA PRKDC. (A) Figury sekwencji barwnika-terminatora ilustrujące zmiany mutacyjne c.10721C> T w allelu pacjenta i matki. (B) Figury sekwencji barwnika-terminatora ilustrujące podwójną sekwencję rozpoczynającą się przy c.1624, wartość bp na granicy między eksonami 15 i 16. (C) Produkty amplifikacji RT-PCR przy użyciu starterów umiejscowionych w eksonach 15 i 17. Komórki kontrolne dawały pojedynczy produkt o wielkości oczekiwanej na obecność eksonu 16. Komórki pacjenta dawały 2 prążki, z których mniejszy był wielkości oczekiwanej dla produktu pozbawionego egzonu 16. Większy sygnał mógłby być wynikiem wzmocnionej amplifikacji mniejszego fragmentu. (D) poziomy transkryptu mRNA, określone przy użyciu starterów specyficznych dla HPRT, allelu WT p.A3574 (PRKDC c.10712C) lub zmutowanego allelu p.A3574V (PRKDC c.10712C> T). Wszystkie linie komórkowe wykazywały taką samą ekspresję HPRT. cDNA komórek kontrolnych 48BR miało 2-krotnie większe poziomy allelu WT w porównaniu z cDNA z komórek macierzystych lub pacjentów, które wyrażały ten sam poziom zmutowanych alleli p.A3574 i p.A3574V. (E) Zachowanie reszty A3574 między gatunkami i lokalizacja zidentyfikowanych zmian mutacyjnych w PRKDC w odniesieniu do ważnych domen. Dodatkowo obserwowaliśmy podwójną sekwencję rozpoczynającą się w c.1624, która reprezentuje granicę między egzonami 15 i 16, co sugeruje, że ekson 16 może być usunięty u pacjenta (Figura 4B)
[przypisy: dyżury aptek kęty, guzowatość piszczeli, olx nowa ruda ]

0 thoughts on “kraków ul białoruska 15”