Skip to content

apteka omega jaktorów

2 miesiące ago

577 words

Plazmidy ekspresyjne DNA WPC-PKcs były takie, jak opisano poprzednio (42). A3574V wytworzono przez syntezę części cDNA DNA-PKcs przez multipleksową PCR pomiędzy miejscami Bglll (nt 10,455) i PmlI (nt 11,146), w tym 3 nt zmian w kodonach 3574. 3,475 (AATGCC> AACGTT), które wprowadziły podstawienie A3574V jako jak również podstawienia niekodujące, które generują nowe miejsce restrykcyjne AclI. Ten fragment Bglll-PmlI subklonowano do fragmentu DNA-PKC obejmującego miejsce SalI (nt 8000) do kodonu terminacji w nt 12,384. Fragment restrykcyjny Fse1 (nt 8160) do Pml1 (nt 11,146) subklonowano do kompletnego DNA-PKcs. Manipulacja cDNA DNA-PKC jest utrudniona przez jego rozmiar i niestabilność. Ostatnio opracowaliśmy alternatywną strategię ekspresji przy użyciu mniejszego plazmidu ekspresyjnego o niskiej liczbie kopii i promotora CAGG. Pokrótce, GFP i kasetę do klonowania umieszczono w plazmidzie o niskiej liczbie kopii pSM7 (dar K. Yu, Michigan State University, East Lansing, Michigan, USA) pomiędzy promotorem CAGG (wyizolowanym z pTriEX-2 neo; Millipore) i miejsce poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (wyizolowane z PefV5His, Invitrogen). Ludzkie DNA-PKcs klonowano pomiędzy unikalnymi miejscami Nhe1 i Not1. cDNA przygotowano z unieśmiertelnionych fibroblastów od pacjentów. RT-PCR przeprowadzono stosując startery obejmujące nt 1000-2360; 2 fragmenty amplifikowano (zi bez eksonu 16, podobnie do figury 3C). Mniejszy fragment subklonowano do pcr2.1 i sekwencjonowano, potwierdzając delecję egzonu 16. Plazmidowy DNA z tego subklonu, jak również konstrukt ekspresyjny DNA-PKC DNA-WT wytworzono z bakterii pozbawionych dcm metylazy. Fragment restrykcyjny (BstZ171, nt 293, do SexAI, nt 1875) obejmujący ekson 16 sklonowano z subklonu RT-PCR pcr2.1 do plazmidu ekspresyjnego DNA CAGG-WT DNA-PKcs. Uzupełnienie pierwotnych ludzkich fibroblastów. Kontrolę 1BR3, pacjenta, zespół 180BR LIGIV i komórki macierzyste hTERT transfekowano pełnej długości WT DNA-PK znakowanym GFP przy użyciu odczynnika Metafectine Pro Transfection (Biotex) zgodnie z protokołem producenta. 24 godziny po transfekcji komórki nie były traktowane (tło) lub eksponowane na 3 Gy IR, zebrane 8 i 16 godzin później i zabarwione na 53BP1. Analizowano tylko komórki GFP +. Klonogenne testy przeżycia. Transfektanty V3 wysiano w gęstościach klonowania szacowanych na uzyskujące wyniki kolonie we wskazanej dawce zeocyny. Po 7 dniach kolonie komórek barwiono 1% (wag./obj.) Fioletem krystalicznym w etanolu i oceniano liczbę kolonii. Przeżywalność wykreślono jako procent w stosunku do nietraktowanych komórek. Testy rekombinacji VDJ. Testy rekombinacji VDJ z zewnątrztrachromosomu przeprowadzono za pomocą kodującego substratu pJH290 (38). Komórki V3 przejściowo transfekowano .g substratu, 6 .g WT lub zmutowanym DNA-PKcs lub wektorem pCMV6 i 3 .g każdego RAG1 i RAG2 stosując odczynnik do transfekcji Fugene6. 48 godzin później plazmidy substratu wyizolowano za pomocą alkalicznej lizy i strawiono DpnI przez godzinę. Strawiony DNA przekształcono w kompetentny DH5. komórki (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Transformowane komórki rozprzestrzeniały się na płytki agarowe LB zawierające 100 .g / ml ampicyliny, same lub w połączeniu z 22 .g / ml chloramfenikolu. Plazmidowy DNA z rekombinowanego pJH290 (połączenia kodujące) wyizolowano i zsekwencjonowano. Immunoblot i pomiar aktywności kinazy białkowej w transfektantach V3. Ekstrakty komórkowe oddzielono za pomocą 4,5% żeli poliakrylamidowych SDS i przeniesiono na membrany PVDF. DNA-PKcs wykrywano stosując przeciwciało monoklonalne r42-27 (podarunek od T. Carter, St. Johns University, New York, New York, USA). Aktywność DNA-PK oceniano jak opisano poprzednio (42). Pokrótce, DNA-PK naniesiono na celulozę DNA Fosforylację biotynylowanego peptydu oceniano przez wychwytywanie na błonach SAM2 (Promega Corp). Aktywność enzymatyczną wyrażono jako inkorporację P-32 (peptyd związany) względem braku kontroli peptydu. Aby ocenić autofosforylację, 100. G całych ekstraktów komórkowych inkubowano w buforze kinazy w pokoju
[więcej w: ślinianki podżuchwowe, co na ugryzienie osy, streptococcus agalactiae w ciąży ]

0 thoughts on “apteka omega jaktorów”