Skip to content

szpital ul chodźki lublin

2 miesiące ago

628 words

Zgodnie z oczekiwaniami, WT DNA-PKcs wspierał znaczny poziom kodowania końcowego łączenia (Figura 6B). Chociaż cDNA A3574V DNA-PKcs wspiera znacznie mniej kodowania końcowego łączenia niż WT DNA-PKcs, uzyskano niski, ale mierzalny poziom połączeń kodujących, co sugeruje, że DNA-PKcs A3574V zachowuje pewną funkcjonalną pojemność. Uznaliśmy, że ten niski poziom kodowania końcowego łączenia może być analogiczny do. Nieszczelnego. łączenie obserwowane w komórkach myszy lub chomika, którym brakuje DNA-PKcs, gdzie uważa się, że w nieszczelnych stawach pośredniczy alternatywny szlak NHEJ. Charakterystyczne dla nieszczelnego łączenia są: nadmierna utrata Nt i długie elementy P. Aby zbadać połączenia utworzone z połączonych stawów, DNA przygotowano z ponownie połączonych substratów plazmidu i zsekwencjonowano. Zaskakująco, kodowanie stawów, w których pośredniczy DNA A3574V-PKcs było nie do odróżnienia od tych utworzonych przez WT DNA-PKcs (Tabela 1). Wnioskujemy, że chociaż A3574V DNA-PKcs nie może wspierać normalnego poziomu końcowego łączenia, końcowe przetwarzanie końców DNA jest normalne, zgodnie z poglądem, że mutant A3574V wspiera obniżone poziomy klasycznej NHEJ. Tabela Tworzenie połączeń za pośrednictwem WT i A3574V DNA-PKcs Na koniec zbadaliśmy, czy DNA-PKcs A3574V zachowuje aktywność enzymatyczną. DNA-PK z ekstraktów V3 naciągnięto na kulki DNA celulozy, a aktywność enzymatyczną mierzono przy użyciu biotynylowanego peptydu p53 jako substratu. Praktycznie nie wykryto żadnej aktywności z komórek wyrażających A3574V DNA-PKcs (Figura 6C). Było to nieco zaskakujące, ponieważ uprzednio wykazano, że aktywność kinazy ma zasadnicze znaczenie dla zdolności DNA-PKcs do wspomagania kodowania końcowego łączenia. Tak więc autofosforylację DNA-PKcs oceniano również jako alternatywną miarę aktywności enzymatycznej, stosując fosfospecyficzne przeciwciało wobec pS2056 DNA-PKcs, dobrze przebadane miejsce autofosforylacji DNA-PKcs (39). Immunoblotting białek reakcji kinazy in vitro (po 5 lub 30 minutach) ujawnił, że DNA-PKcs A3574V przeszedł autofosforylację, chociaż z wolniejszą kinetyką iz mniejszą wydajnością niż białko WT (Figura 6D). Wnioskujemy, że DNA-PKcs A3574V ma resztkową, ale znacznie osłabioną aktywność katalityczną. Utrata egzonu 16 nie spowodowała zmiany ramki, ale kodowane białko nie zawierało aminokwasów 541. 592. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że PRKDC nie toleruje delecji (40, 41). Ponadto, usunięty region jest wysoce zakonserwowany u PRKDC kręgowców i, jak wynika z dostępnych badań strukturalnych, znajduje się wewnątrz N-końcowego. Cęgów. domena. DNA cDNA DNA-PKC bez egzonu 16 wytworzono, a jego funkcję oceniano w komórkach V3. Ekspresja DNA-PKcs w klonach V3 wyrażających delecję eksonu 16 była znacznie niższa niż w komórkach eksprymujących białko WT (Figura 6). Co więcej, klony nie odwracały wrażliwego na zeocynę fenotypu komórek V3, nie wspierały końcowej rozdzielczości kodującej VDJ i nie dawały wykrywalnych aktywności DNA-PKcs przy użyciu testów opisanych powyżej. Łącznie odkrycia te dostarczają mocnych dowodów, że utrata egzonu 16 dramatycznie wpływa na funkcję i prawdopodobnie reprezentuje zerową mutacyjną zmianę. To odkrycie jest zgodne z naszymi poprzednimi badaniami mutacyjnymi DNA-PKcs, pokazującymi, że małe delecje N-końcowe całkowicie znoszą funkcję i że inne warianty DNA-PKcs z pominiętymi eksonami są podobnie niefunkcjonalne (40, 41). Podsumowując, chociaż komórki wykazujące ekspresję A3574V DNA-PKcs były podobnie wrażliwe na DSB indukowane przez zeocynę jako komórki nie wyrażające DNA-PKcs, zmutowane białko zachowywało resztkową aktywność katalityczną, wspierając niski poziom kodowania końcowego łączenia. Jest to zgodne z wcześniejszymi sugestiami, że bardzo niskie poziomy aktywności DNA-PKcs są wystarczające do wspierania rekombinacji V (D) J, ale niewystarczające do odwrócenia fenotypu wrażliwości na promieniowanie wywołanego przez niedobór DNA-PKcs (30, 42).
[podobne: adrenoleukodystrofia, ślepota zmierzchowa, pękające pięty przyczyny ]

0 thoughts on “szpital ul chodźki lublin”