Skip to content

aparat stały cienkołukowy metalowy

1 miesiąc ago

608 words

Analiza naprawy DSB była taka, jak opisano poprzednio (8). Immunofluorescencja i immunoblotting. W przypadku immunofluorescencji przeciwciała anty-53BP1 lub anty-H2 H2AX pochodziły odpowiednio od Millipore i Bethyl. Wtórne przeciwciała pochodziły z Dako. Komórki utrwalono w 3% paraformaldehydzie, 2% roztworze PBS sacharozy, przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) i permeabilizowano w 20 mM HEPES (pH 7,4), 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM sacharozie i 0,5% Triton X -100 (Sigma-Aldrich) przez 2 minuty w 4 ° C. Inkubacje pierwotnych przeciwciał prowadzono przez 40 minut w 37 ° C w PBS uzupełnionym 2% BSA (Sigma-Aldrich). Wtórne inkubacje z przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim FITC lub przeciwciałem przeciw krionowemu Cy3 (Sigma-Aldrich) przeprowadzono w 37 ° C w 2% BSA przez 20 minut. Jądra barwiono kontrastowo DAPI (Sigma-Aldrich), a szkiełka nakrywkowe montowano w podłożu montażowym Vectashield (Vector Laboratories). W przypadku immunoblottingu, 25 lub 50 .g ekstraktów z całych komórek rozdzielono na 7,5% żelach PAGE. Po przeniesieniu do błon PVDF i zablokowaniu za pomocą 25% odtłuszczonego mleka w proszku w buforze TTBS (20 mM Tris Base . HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl i 0,1% Tween-20), bloty inkubowano przez noc w 4 ° C z antybiotykiem. XLF (Eurogentec), anty-XRCC4 (Serotec), anty-KU70 (Santa Cruz), anty-KU80 (Cell Signaling), anty-DNA-LIGIV (Serotec), anty-Lis1 (Santa Cruz) lub anty-DNA- PK przeciwciało poliklonalne (DPK-1, dostarczone przez S. Lees-Millera, University of Calgary, Calgary, Alberta, Kanada). Bloty inkubowano z drugorzędowymi przeciwciałami HRP królika, kozy lub myszy (Dako). Test kinazy DNA-PKcs. Aktywność kinazy DNA-PK mierzono za pomocą testu rozwijania (54). Pokrótce, ekstrakty całych komórek z fibroblastów hTERT zmieszano z 5 mg celulozy dsDNA (Sigma-Aldrich) i inkubowano na lodzie przez 30 minut w temperaturze 4 ° C, a następnie wirowano. Peletki zawierające DNA-PKcs związane z celulozą DNA zostały przemyte, ponownie zawieszone i inkubowane z biotynylowanym substratem peptydowym dostarczonym w zestawie do testu kinazy DNA SigmaTECT-PK (Promega) w obecności [a-32P] ATP przez 10 minut w 30 ° C. DO. Reakcje zatrzymano przez dodanie CH3COOH, nakropiono na 1,5 cm2 papier fosfocelulozowy (papier kationowo-wymienny klasy P91, Whatman) i przemyto 3. 4 razy w 200 ml 15% CH3COOH. Po wysuszeniu na powietrzu sygnał oznaczono ilościowo za pomocą STORM PhosphoImager (Molecular Dynamics / GE Healthcare). Sekwencjonowanie DNA-PK. cDNA zsyntetyzowano z całkowitego RNA stosując losowe startery heksamerowe i odwrotną transkryptazę SUPERSCRIPT II (Invitrogen). 9 zachodzących na siebie fragmentów poddano amplifikacji PCR przy użyciu polimerazy KOD (Merck Biosciences) w następujący sposób: 94 ° C przez 2 minuty; 35 cykli w 94 ° C przez 15 sekund, 54 ° C przez 30 sekund i 68 ° C przez 90 sekund; i 68 ° C przez 10 minut. Każdy fragment amplifikowano 3 razy w oddzielnych reakcjach PCR, oczyszczano na żelu i sekwencjonowano w obu kierunkach przy użyciu zestawu ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit V1.1 (Applied Biosystems). Aby potwierdzić delecję eksonu 16, fragment PCR obejmujący eksony 15 (17 sklonowano w wektorze pGEM-5 i zsekwencjonowano poszczególne klony. Genomowy DNA ekstrahowano przy użyciu zestawu DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) i amplifikowano w 3 zachodzących na siebie fragmentach. Analiza qPCR. Poziomy transkryptu mRNA dla PRKDC c.10721C i alleli c.10721T w komórkach pacjenta, komórkach macierzystych i komórkach kontrolnych 48BR określano ilościowo za pomocą testu PCR z cyklem czasu rzeczywistego (Cycleave-qPCR; TaKaRa Co. Ltd.). HPRT1 służyło jako kontrola ilościowa. Zastosowano wrażliwe na RNaseH 2-kolorowe sondy fluorescencyjne, które selektywnie rozpoznają allele PRKDC c.10721C i c.10721T. Wyniki qPCR analizowano metodą Ct. Startery qPCR i sondy były następujące: PRKDC c.10721 do przodu, 5a -ATAAGGAGTTTGTGGCAAGG-3 .; PRKDC c.10721 wsteczny, 5a-CCAAGGCTGCATACATTC-3; PRKDC c.10721C WT, (Eclipse) 5. -DAdAdG (rG) dCdAdTdTdAdAdTdA-3. (FAM); Mutant PRKDC c.10721T, (Eclipse) 5. -DAdAdG (rA) dCdAdTdTdAdAdTdAdAdA-3. (ROX); HPRT1 do przodu, 5a-CAGGCAGTATAATCCAAAGATG-3 .; HPRT1 reverse, 5a -ACTGGCGATGTCAATAGGA-3 .; Sonda HPRT1, (Eclipse) 5a-dCdAdGdCdA (A) dGdCdT-3. (FAM). Plazmidy i transfektanty
[podobne: podgłośniowe zapalenie krtani, gamma glutamylotranspeptydaza, pękające pięty przyczyny ]

0 thoughts on “aparat stały cienkołukowy metalowy”

  1. [..] Oznaczono ponizsze tresci z artykulu oryginalnego: prywatny ośrodek leczenia alkoholizmu[…]