Skip to content

poradnia chirurgiczna poznań mickiewicza

1 miesiąc ago

634 words

Szczep 12005000131-1 został dostarczony przez Elizabeth Cebelinski (Sekcja Epidemiologii Molekularnej Laboratorium Chorób Zakaźnych, Departament Zdrowia w Minnesocie, St. Paul, Minnesota, USA). Ekspresja i oczyszczanie białek. Wydzielona 2-partnerowa glikoproteina EtpA została oczyszczona z supernatantów hodowli plazmidów E. coli Top10, które powodują koekspresję pJL017 i pJL030 (81). W skrócie, E. coli Top10 niosące pJL017 i pJL030 (tabela dodatkowa 5) hodowano w LB z ampicyliną (100 ug / ml) i chloramfenikolem (15 ug / ml) w 37 ° C, w inkubatorze z wytrząsaniem przy 230 obrotach na minutę, aż OD600 nm osiągnęło w przybliżeniu 0,5. 0,6. Następnie ekspresję rekombinowanego białka indukowano 0,0002% arabinozy przez 6 godzin w 37 ° C. Supernatant hodowli zatężono przy użyciu filtru o ciężarze cząsteczkowym 100 kD (MWCO) (Millipore) i białko rEtpA-myc-6His oczyszczono stosując chromatografię powinowactwa na immobilizowanym metalu, jak opisano wcześniej (81). Frakcjonowanie subkomórkowe ETEC i analiza dalekowschodnia. ETEC H10407 hodowano przez noc w 10 ml hodowlach LB w 37 ° C, jak opisano powyżej, rozcieńczono do 500 ml hodowli następnego dnia rano i hodowano przez 3 godziny w 37 ° C. Komórki zebrano przez odwirowanie przy 5000 g przez 10 minut w 4 ° C i osad ponownie zawieszono w 8 ml 50 mM buforu Tris o pH 7,8 zawierającego mM EDTA i mg DNAzy. Subkomórkowe frakcje następnie przygotowano w sposób opisany uprzednio (82). W skrócie, komórki rozbito przy użyciu prasy francuskiej, a następnie dodano 2 mM MgCl2 do lizatu E. coli i wirowano przy 5000 g przez 10 minut w temperaturze 4 ° C w celu usunięcia dużych resztek / nienaruszonych komórek. Supernatant zebrano, uzupełniono PMSF do końcowego stężenia mM i ultrawirowano przy 100 000 g przez godzinę w temperaturze 4 ° C. Supernatant z tego etapu został zapisany jako frakcja cytosolowa. Pozostały osad komórek ponownie zawieszono w lodowatym 10 mM HEPES o pH 7,4, ułożonym na gradient 69%, 52,8% i 26,4% sacharozy w HEPES pH 7,4 i odwirowano przy 113 000 g przez 16 godzin w temperaturze 4 ° C. Widoczna górna warstwa zawierająca wewnętrzne membrany i dolną warstwę o dużej gęstości z zewnętrznymi membranami została zebrana. Białka błonowe rekonstytuowano w lodowatym HEPES pH 7,4 i wirowano przez godzinę przy 100 000 g, 4 ° C. Na koniec, peletki białkowe z błon wewnętrznych i zewnętrznych ponownie zawieszono w 0,25 i 0,5 ml dH2O, odpowiednio. Far-Western blotting zastosowano do testowania interakcji glikanu grupy A z białkami ETEC. Pokrótce, około 10 .g białek ETEC rozdzielono przez SDS-PAGE na 4%. 20% żel Tris-glicyny (NuPAGE Gel) (Life Technologies) i przeniesiono na błony nitrocelulozowe. Membrany blokowano 5% BSA w TBS-T (buforowana sól Tris [hydroksymetylo] aminometanu, 0,01% Tween-20) przez godzinę, a następnie inkubowano z końcowym stężeniem 5 ug / ml biotynylowanego wieloważnego trisacharydu grupy krwi A (Glycotech; 01-032) przez noc w 4 ° C. Biotynylowane glikany wykrywano stosując koniugat streptawidyna-HRP (SA-HRP) (1: 20 000), a EtpA wykrywano metodą immunoblottingu stosując przeciwciało poliklonalne królika przeciw EtpA. Badania hemaglutynacji. Zbadaliśmy zdolność EtpA do aglutynacji ludzkich erytrocytów należących do grup krwi A1, A2, B i O (Immucor, katalog 0002338). W skrócie, 2-krotne rozcieńczenia rEtpA w PBS w końcowej objętości 10 ul zmieszano z 40 ul około 1% zawiesiny komórek (w PBS) krwinek czerwonych wykazujących ekspresję antygenów A1, A2, B i O w 96%. dobrze okrągłodenne płytki, następnie inkubowano przez 30 minut w 4 ° C. Następnie płytki obrazowano w celu pokazania aglutynowanych względem niezaglutynowanych (ustalonych) erytrocytów. W równoległych eksperymentach, rekombinowany znakowany polihistydyną EtpA był immobilizowany na impregnowanych kobaltem superparamagnetycznych kulkach polistyrenowych (Dynabeads TALON, Thermo Fisher, katalog 101.01D), które następnie inkubowano z RBC. Aby zbadać specyficzność indukowanej przez EtpA aglutynacji krwinek czerwonych eksprymujących antygen A, testy aglutynacji przeprowadzono w obecności nadmiarowych cukrów specyficznych dla poszczególnych typów krwi: GalNAc (grupa krwi A), Gal (grupa krwi B) lub kontrolna GlcNAc przy końcowym stężeniu 50 mM
[więcej w: ślepota zmierzchowa, gamma glutamylotranspeptydaza, podgłośniowe zapalenie krtani ]

0 thoughts on “poradnia chirurgiczna poznań mickiewicza”

  1. [..] Blog oznaczyl uzycie nastepujacego fragmentu najlepsza dieta pudełkowa[…]